在PCR反應時，試管內的反應液會受熱蒸發(fā)，產生的蒸氣會在試管蓋處凝結。這會導致PCR反應體積發(fā)生變化，從而影響最終實驗結果的準確性。為了避免這些問題的發(fā)生，保證PCR反應過程的穩(wěn)定和結果的精確性，研究人員開始開發(fā)熱蓋裝置，以解決反應體系的蒸發(fā)和溫度不均等問題。
一、熱蓋的作用：
1、防止樣品蒸發(fā)
PCR反應體系的體積通常很小，只有20~50μL。在高溫變性步驟（約95°C）時，水分很容易蒸發(fā)。要是不蓋熱蓋，高溫會導致反應管內液體蒸發(fā)并凝結在管壁或管蓋內表面，造成樣品體積減少、反應體系失衡，以及關鍵試劑濃度（如引物、模板、dNTP）變化，進而影響擴增效果。而熱蓋可以防止反應管頂部冷凝水的形成，從而避免反應液體的蒸發(fā)。
2、提高擴增效率和重復性
加熱蓋子可以確保反應體系的溫度更加均勻，減少溫度梯度的影響。溫度的均勻分布可以確保所有模板DNA分子都能均勻地經歷變性、退火和延伸步驟，從而提高擴增效率。同時，防止蒸發(fā)也有助于維持反應體系的穩(wěn)定性，減少非特異性擴增的風險，進而提高實驗的重復性。
3、防止冷凝水污染
冷凝水可能攜帶雜質或污染物滴回反應液中，加熱蓋子可以減少這種風險。
4、簡化操作流程
在傳統(tǒng)PCR中，為防止蒸發(fā)，需要在反應管表面覆蓋一層礦物油。這種方法不僅操作麻煩，還容易造成污染。而加熱蓋子的設計免去了使用礦物油的需求，從而簡化了操作流程，并減少了污染風險。
二、選擇105°C加熱蓋原因：
在PCR過程中，變性步驟是最為關鍵的一步，它需要將雙鏈DNA分離成單鏈，以便引物能夠結合并開始合成新的DNA鏈。這一步驟通常在95°C下進行，而選擇105°C作為加熱蓋的溫度設置，主要有以下幾個原因：
1、更有效地分離DNA雙鏈
在更高的溫度下，氫鍵更容易斷裂，從而更快速、更徹底地分離雙鏈DNA。這不僅提高了變性的效率，還能減少非特異性擴增，因為非特異性結合的DNA模板在高溫下更容易被分離。
2、提高PCR反應的特異性和效率
雖然更高的溫度可能會對PCR酶的活性產生一定影響，但這也意味著只有高度特異性的引物-模板結合才能在退火步驟中存活下來。因此，105°C的加熱蓋溫度有助于提高PCR反應的特異性和效率。
3、優(yōu)化實驗結果
在不同的實驗條件下，105°C加熱蓋可以幫助優(yōu)化結果。例如，在處理高GC含量的DNA模板時，高溫可以提高PCR的效率，因為高GC含量的DNA在高溫下更容易變性。此外，在進行多重PCR時，105°C的加熱蓋有助于減少由于不同引物對的Tm值差異引起的非特異性擴增。
三、加熱蓋對PCR實驗結果的影響
1、準確性
使用105°C加熱蓋對實驗結果的準確性有著顯著影響。在PCR過程中，溫度的精確控制是確保特異性擴增的關鍵。105°C的高溫有助于確保DNA雙鏈完全變性，減少引物二聚體和其他非特異性產物的形成，從而提高擴增的特異性以及實驗結果的準確性。
2、適用性
在特定類型的PCR實驗中，如實時定量PCR（qPCR）和高分辨率熔解曲線分析（HRM），105°C加熱蓋的重要性尤為突出。在qPCR中，高溫有助于減少非特異性擴增，從而提高數(shù)據(jù)的可靠性。在HRM中，精確的溫度控制對于區(qū)分單核苷酸多態(tài)性（SNPs）至關重要，105°C的高溫有助于確保DNA完全變性，從而獲得更清晰的熔解曲線。
四、加熱蓋故障及解決方法
盡管加熱蓋在PCR擴增過程中起著重要作用，但它也可能出現(xiàn)故障。常見的故障包括溫度傳感器損壞或失效、加熱元件故障以及控制器故障等。這些故障可能導致熱蓋無法準確地達到或維持設定的溫度。針對這些故障，可以采取以下解決方法：
1、檢查傳感器連接
確保傳感器與主控板的連接良好，并通過實驗室溫度計驗證熱蓋溫度的準確性。
2、更換加熱元件
檢查加熱元件是否損壞或短路，并更換或修理損壞的元件。同時，確保加熱元件的供電線路正常。
3、檢修控制器
檢查控制器的設置是否正確，并確保其電源連接良好。如果以上方法無效，建議聯(lián)系PCR儀器供應商或維修人員進行檢修或更換控制器。
